Principi fluorescentne mikroskopije
Fluorescencijski mikroskopi se razlikuju od običnih optičkih mikroskopa. Umjesto da promatraju uzorke pod osvjetljenjem običnih izvora svjetlosti, oni koriste svjetlost određene valne dužine (obično ultraljubičasto svjetlo, plavo-ljubičasto svjetlo) da pod mikroskopom potaknu fluorescentne tvari u uzorcima kako bi emitovali fluorescenciju. Stoga, izvor svjetlosti fluorescentnog mikroskopa ne funkcionira kao direktno osvjetljenje, već kao izvor energije koji pobuđuje fluorescentne tvari unutar uzorka. Razlog zašto možemo promatrati uzorak je zbog osvjetljenja izvora svjetlosti, ali fenomen fluorescencije koji se pojavljuje nakon što fluorescentna supstanca u uzorku apsorbira pobuđenu svjetlosnu energiju.
Vidi se da je karakteristika fluorescentnog mikroskopa da njegov izvor svjetlosti može isporučiti veliku količinu ekscitacijske svjetlosti u određenom opsegu talasnih dužina, tako da fluorescentna supstanca u ispitivanom uzorku može da dobije ekscitaciono svetlo potrebnog intenziteta. Istovremeno, fluorescentni mikroskop mora imati odgovarajući sistem filtera.
Fluorescentna mikroskopija je bitan alat u imunofluorescentnoj histohemiji. Sastoji se od ultravisokog izvora svetlosti, sistema filtera (uključujući filtersku ploču za pobuđivanje i potiskivanje), optičkog sistema i sistema za fotografisanje i drugih glavnih komponenti. Koristi svjetlost određene valne dužine da potakne uzorak da emituje fluorescenciju.
Način pobuđivanja fluorescencije: Prema opsegu talasne dužine svetlosti, može se podeliti na dva tipa: UV ekscitacioni metod (koristeći metodu ultraljubičastog osvetljenja) i BV metod ekscitacije (koristeći plavo-ljubičasto svetlo). Metoda UV ekscitacije koristi skoro ultraljubičasto svjetlo kraće od 400 nm za pobuđivanje. U ovoj metodi nema vidljive ekscitacijske svjetlosti, tako da uočena fluorescencija predstavlja inherentnu fluorescenciju boje i lako je razlikovati specifičnu fluorescenciju na uzorku od autofluorescencije pozadinskog tkiva.
BV metoda ekscitacije je bazirana na 404nm i 434nm za pobuđivanje od ultraljubičastog do plavog svjetla. Ova metoda koristi plavo svjetlo za ozračivanje uzorka, tako da granični filter sistema za posmatranje fluorescencije mora koristiti filter koji može u potpunosti blokirati plavo svjetlo i u potpunosti proći potrebnu zelenu i žutu fluorescenciju. Fluorescentne boje za testove fluorescentnih antitijela. Maksimalna apsorpciona talasna dužina ekscitacionog svetla je relativno bliska maksimalnoj talasnoj dužini emisije fluorescencije, tako da filter koji se koristi u BV metodi ekscitacije mora da koristi oštar filter za odsecanje. Ova metoda može koristiti plavo svjetlo kao pobudno svjetlo, tako da je efikasnost apsorpcije fluorescentnog pigmenta veća i može se dobiti svjetlija slika. Njegov nedostatak je što se fluorescencija ispod 500nm ne može vidjeti, a fluorescencija iznad 500nm čini da cijela slika izgleda žuto. U metodi fluorescentnih antitijela, specifičnost fluorohroma se često procjenjuje prema boji jedinstvenoj za fluorohrom. Stoga, kada se govori o suptilnoj specifičnosti, gore navedeni nedostaci metode BV ekscitacije često imaju veliki uticaj.
Da sumiramo, osvjetljenje fluorescentnog mikroskopa može se razmatrati prema sljedeće tri tačke prema strukturi kondenzatora i talasnoj dužini ekscitacionog svjetla.
① Iz perspektive zahtjeva za kontrastom fluorescentne slike, UV ekscitacijski koncentrator tamnog polja se koristi za osvjetljenje.
② Uzimajući u obzir svjetlinu slike, BV ekscitacioni filter ima najveću efikasnost posmatranja tamnog polja.
③Karakteristike posmatranja tamnog polja UV filtera ekscitacije i osvetljenja koncentratora tamnog polja ekscitacije BV mogu se smatrati između ove dve metode osvetljenja, ali prva ima jača svojstva tamnog polja i prikazuje svetlije slike. Kontrast je mali; potonji zadržava svojstva svjetlosne putanje tamnog polja, pa je prikazana slika tamnija, a kontrast je poboljšan. Kada se zapravo koristi fluorescentni mikroskop, za posmatranje treba koristiti metodu osvjetljenja koja najbolje odgovara zahtjevima uzorka.
Mora se naglasiti da čak i ako je UV pobuđeni kondenzator tamnog polja sa najboljim kontrastom osvijetljen, dio ultraljubičaste ekscitacijske svjetlosti koju prelomi ili rasprši uzorak će ući u sočivo objektiva. Autofluorescencija može pogoršati odgovor slike. Zbog toga se filter koji apsorbuje UV mora koristiti ispred okulara kao filter za odsecanje.
